【細胞課堂】原代細胞培養的分離純化

原代細胞、傳代細胞絕大多數都呈混合生長，既有上皮樣細胞又有纖維樣細胞，纖維樣細胞又包括成纖維細胞、肌細胞、骨細胞、滑膜細胞等。混雜的細胞會直接影響實驗結果。

在體外培養原代細胞時，為了保證實驗結果的可靠性、一致性、穩定性、和可重復性，要求采用單一種類細胞來進行實驗，這樣才能對某一細胞的功能、形態等變化進行一系列研究，因而培養細胞的純化就成為實驗研究的重要一步，甚至需要從混雜的細胞群中分離出單個細胞來進行培養和開展實驗研究。

一、原代細胞增殖優勢純化方法：

自然純化是利用某一種類細胞的增殖優勢，在長期傳代過程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長慢的細胞，靠自然增殖的潛力，最后留下生長優勢旺盛的細胞，達到細胞純化的目的。但這種方法常無法按照需要和實驗要求及研究目的來選擇細胞。此法花費時間長，留下的往往是成纖維細胞。僅有那些惡變的腫瘤細胞或突變的細胞可以通過此方法而保留下來的，不斷純化而建立細胞系。

二、原代細胞常用純化方法：

人工純化是利用人為手段造成對某一細胞生長有利的環境條件，抑制其他細胞的生長從而達到純化細胞的目的。

 1、細胞時間差酶消化法：

酶消化法是比較常用的純化方法，不僅對貼壁細胞可行，能利用上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受性不同，是兩者分開，達到純化的目的；另外對貼壁細胞與半貼壁細胞及黏附細胞間的分離純化也是十分有效的。

兩者在胰蛋白酶的作用下，由于成纖維細胞先脫壁，而上皮細胞要消化相當長的時間才脫壁，特別是在原代細胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯，故可采用多次差別消化方法將上皮細胞和成纖維細胞分開，方法步驟如下：

采用常規消化傳代方式將0.25%胰蛋白酶注入培養瓶內兩次，每次加1ml（25ml培養瓶），來回輕搖1-2次，使胰蛋白酶流過所有細胞表面，然后倒掉。

蓋好瓶塞，將培養瓶放在倒置顯微鏡下觀察，發現成纖維細胞變園，部分脫落，立即加入2ml有血清的培養基終止消化。

用彎頭吸管輕輕吹打成纖維細胞生長區域（可事先在鏡下用記號筆在培養瓶上劃出記號）。吹打時不要用力，也不要吹打上皮細胞生長區域。吹打結束后，再用少量培養基漂洗一遍，然后加入適量培養基于瓶內繼續培養，也可重復上述操作再進行一次。

隔幾日后或下次傳代時，再進行上述操作，進過幾次處理，就可將成纖維細胞去除或者將兩者分開。

2、細胞培養機械刮除法：

原代培養時，如果上皮細胞和成纖維細胞分為區成混雜生長，每種細胞都以小片或區域性分布的方式生長在瓶壁上。可采用機械的方法去除不需要的細胞區域而保留需要的細胞區域，其方法步驟如下 ：

將要純化細胞的培養瓶，在凈化室內放在倒置顯微鏡監視下進行操作。

用硅橡膠刮子在不需要生長的細胞區域推劃，使細胞懸浮在培養基中，注意不要傷及所需細胞。

推劃后用培養基沖洗振搖兩次倒掉，即可將培養基加入原瓶繼續培養。

數日后如發現不需要的細胞又長出，可再進行上述操作，這樣反復多次可以純化細胞。操作過程中要嚴格無菌操作，防止污染。

3、細胞反復貼壁法：

成纖維細胞與上皮細胞相比，其貼壁過程快，大部分細胞能在短時間內（大約10-30min）完成附著過程（但不一定*伸展），而上皮細胞（大部分）在短時間內不能附著或附著不穩定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細胞。

將細胞懸液接種在一個培養內（最好培養基內不含血清，此時上皮細胞貼壁更慢）靜置20min。

在倒置顯微鏡下觀察，見部分細胞貼壁，稍加搖動也不浮起時，將細胞懸液導入另一培養瓶中。

繼續靜置培養20min，然后重復上述操作后，即可將上皮細胞和成纖維細胞分隔開，在第一瓶和第二瓶以成纖維細胞為主，往后幾瓶即以上皮細胞為主，下次傳代時再按上述方法處理，就可使兩者達到*分開的目的。

4、細胞電烙篩選法：

在貼壁細胞轉化時，往往在培養瓶的細胞層中會出現分散的轉化灶，轉化灶區域細胞密集、排列規則，有明顯生長趨勢，與周邊未能轉化的細胞有明顯的區域界限，此時即可用機械刮除法取出未轉化細胞，也可用電烙篩選法燙死未轉化細胞而保留轉化灶細胞。

倒去原液，并用記號筆劃出轉化灶的區域。

用加熱的微型電烙器（類似焊接用的電烙鐵）將轉化灶周邊的細胞全部燙死，只保留轉化灶細胞。在單細胞克隆篩選時，也可用此法將單個細胞周圍的細胞殺死。

然后在適應性培養基中（50%是原液）繼續培養，即可達到純化的目的。