定量檢測試劑盒（ELISA）實驗要求及步驟

　　【樣本要求】
　　
　　1、樣本不能含疊氮鈉（NaN3），因為疊氮鈉（NaN3）是辣根過氧化物酶（HRP）的抑制劑。
　　
　　2、標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能立即試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免

反復(fù)凍融。
　　
　　3、樣本應(yīng)充分離心，不得有溶血及顆粒。
　　
　　【注意事項】
　　
　　1、實驗嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，實驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。
　　
　　2、酶標(biāo)包被板開封后如未用完，應(yīng)立即裝入密封袋中加干燥劑保存。
　　
　　3、建議所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對照都做雙份檢測，取平均值，以減小實驗誤差。
　　
　　4、牢記樣本已經(jīng)稀釋5倍，計算結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度。
　　
　　5、本試劑盒定量范圍為15.6-1000pg/ml，超過此范圍，為標(biāo)準(zhǔn)曲線延伸計算所得，不做為準(zhǔn)確定量結(jié)果，請用特殊稀釋液稀釋后測定

準(zhǔn)確結(jié)果（15.6-1000pg/ml范圍內(nèi)），乘以總稀釋倍數(shù)即為樣本zui終濃度。
　　
　　6、若顯色過淺，可適當(dāng)延長底物溫育時間。
　　
　　7、為避免交叉污染，標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對照每加一個就要更換一次吸頭；酶標(biāo)工作液、樣本稀釋液和底物等公共組分，要懸臂加樣

，不得碰到微孔；不得重復(fù)使用封板膜。
　　
　　8、試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用，不同批號的試劑不得混用。
　　
　　9、底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。
　　
　　【操作程序總結(jié)】
　　
　　準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品
　　
　　加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)30分鐘
　　
　　洗板4次，加入酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)30分鐘
　　
　　洗板4次，加入顯色液A、B，37℃顯色15分鐘
　　
　　加入終止液
　　
　　15分鐘之內(nèi)讀OD值
　　
　　計算
　　
　　【檢測范圍】
　　
　　15.6-1000pg/ml
　　
　　【規(guī)格】
　　
　　96T/盒
　　
　　【貯藏】
　　
　　2-8℃，避光防潮保存。
　　
　　【有效期】
　　
　　6個月

　　1、37℃恒溫箱
　　
　　2、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
　　
　　3、精密移液器及一次性吸頭
　　
　　4、蒸餾水
　　
　　5、一次性試管
　　
　　6、吸水紙
　　
　　【操作步驟】
　　
　　1、準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30分鐘。
　　
　　2、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。
　　
　　3、加標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本：取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板，固定于框架上，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置，

在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μL；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5倍）；空白對照孔不加。
　　
　　4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
　　
　　5、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機按說

明書操作洗板）。
　　
　　6、加酶標(biāo)工作液：每孔加入酶標(biāo)工作液50μL，空白對照孔不加。
　　
　　7、溫育：重復(fù)4的操作。
　　
　　8、洗板：重復(fù)5的操作。
　　
　　9、顯色：每孔先加入顯色劑A液50μL，再加入顯色劑B液50μL，37℃避光顯色15min。
　　
　　10、終止：取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
　　
　　11、測定：以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi)，用450nm波長測量各孔的吸光值（OD值）。
　　
　　12、計算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品

濃度，也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。zui終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)。
　　
　　大鼠雌二醇（E2）定量檢測試劑盒（ELISA）說明書