細(xì)胞因子檢測法

 　　細(xì)胞因子（cytokine）是由細(xì)胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物質(zhì)的統(tǒng)稱。在免疫應(yīng)答過程中，細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)、炎癥應(yīng)答、腫瘤轉(zhuǎn)移等生理和病理過程中起重要作用。細(xì)胞因子的檢測不僅是基礎(chǔ)免疫研究的有較手段，同時在臨床疾病診斷、病程觀察、療效判斷及細(xì)胞因子治療監(jiān)測方面具有重要價值。

　　但是，由于細(xì)胞因子在體內(nèi)的含量甚微，給細(xì)胞因子的檢測帶來困維，細(xì)胞因子的檢測尚未在臨床診斷上廣泛開展，已知目前采用的細(xì)胞因子檢測方法均不完善，且不同的檢測方法所得的結(jié)果差異較大，給臨床診斷與治療帶來一定的困難。因此，有必要了解各種檢測方法的特性及影響因素。

　　目前，細(xì)胞因子生物學(xué)活性檢測和濃度測定方法主要有以下幾類。

　　一.生物學(xué)檢測法

　　生物學(xué)檢測又稱生物活性檢測，是根據(jù)細(xì)胞因子特定的生物活性而設(shè)計的檢測法。由于各種細(xì)胞因子具有不同的活性，例如IL-2促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，TNF殺傷腫瘤細(xì)胞，CSFci 激造血細(xì)胞集落形成，IFN保護(hù)細(xì)胞免受病毒攻擊，因此選擇某一細(xì)胞因子*的生物活性，即可對其進(jìn)行檢測。生物活性檢測法又可分為以下幾類：

　　1.細(xì)胞增殖法

　　許多細(xì)胞因子具有細(xì)胞生 zhang 因子活性，特別是白細(xì)胞介素，如IL-2 ci激t細(xì)胞生 zhang 、IL-3 ci 激肥大細(xì)胞生 zhang 、IL-6 ci 激漿細(xì)胞生 zhang 等。利用這一特性，現(xiàn)已篩選出一些對特定細(xì)胞因子起反應(yīng)的細(xì)胞，并建立了只依賴于某種因子的細(xì)胞系，即依賴細(xì)胞株（簡稱依賴株）。這些依賴株在通常情況下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依賴株ctll-2在不含IL-2的培養(yǎng)基中很快死亡，而加入IL-2后則可右體外 zhang 期培養(yǎng)。在一定濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞增殖與IL-2量呈正比，因此通過測定細(xì)胞增殖情況（如使用3h-tdr摻入法、MTT法等）鑒定IL-2的含量。除依賴株外，還有一些短期培養(yǎng)的細(xì)胞，如胸腺細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、促有絲分裂原ci 激后的淋巴母細(xì)胞等，均可作為靶細(xì)胞來測定某種細(xì)胞因子活性。

　　2.細(xì)胞因子誘導(dǎo)的產(chǎn)物分析法

　　某些細(xì)胞因子可ci激特定細(xì)胞產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，如IL-2、IL-3誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞合成胺、IL-6誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成α1-抗糜蛋白酶等。通過測定所誘生的相應(yīng)產(chǎn)物，可反映細(xì)胞因子的活性。

　　3.靶細(xì)胞殺傷法

　　是根據(jù)某些細(xì)胞因子（如TNF）能在體外殺傷靶細(xì)胞而設(shè)計的檢測方法。通常靶細(xì)胞多選擇體外zhang 期傳代的腫瘤細(xì)胞株，利用同位素釋放法或染料染色等方法判定細(xì)胞的殺傷率。

　　4.細(xì)胞病變抑制法

　　病毒可造成靶細(xì)胞的損傷，干擾素等則可抑制病毒所導(dǎo)致的細(xì)胞病變，因此可利用細(xì)胞病變抑制法檢測這類因子。

　　二、分子生物學(xué)方法

　　這是一類利用細(xì)胞因子的基因探針檢測特定細(xì)胞因子基因表達(dá)的技術(shù)。目前所有*的細(xì)胞因子的基因均已克隆化，故能較容易地得到某一細(xì)胞因子的cDNA探針或根據(jù)已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探針。利用基因探針檢測細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的方法多種多樣，常使用斑點雜交、Northern blot、逆轉(zhuǎn)錄PCR，細(xì)胞或組織原位雜交等。實驗的關(guān)鍵在于制備高質(zhì)量的核酸探針和獲得合格的待測物（提取的mRNA樣品或細(xì)胞/組織標(biāo)本）。核酸探針是指一段用放射性同位素或其他標(biāo)記物（如生物素、地高辛等）標(biāo)記并與目的基因互補(bǔ)的DNA 片段或單鏈DNA、RNA。根據(jù)其來源可分為cDNA探針、寡核核苷酸探針、基因組基因探針及DNA探針等。其中cDNA探針和人工合成寡核苷酸探針常用于斑點雜交及Northern blot，而RNA探針因穿透性好更適用于原位雜交。

　　核酸探針技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)程序化，以cDNA探針為例主要包括：

　　①質(zhì)粒DNA的提取;

　　②靶DNA 片段的分離;

　　③靶DNA 片段標(biāo)記;

　　④待測樣品mrna的提取;

　　⑤標(biāo)記cDNA探針對待檢樣品的雜交;

　　⑥放射自顯影或顯色分析。近年來出現(xiàn)的RT-PCR檢測特異性mRNA的方法也廣泛用于細(xì)胞因子研究領(lǐng)域。該法具有靈敏、快速等優(yōu)點，甚至從1～10個細(xì)胞中就可檢出其中的特異mRNA。

　　三、免疫學(xué)檢測法

　　細(xì)胞因子均為蛋白或多肽，具有較強(qiáng)的抗原性。隨著重組細(xì)胞因子的出現(xiàn)，可較方便地獲得細(xì)胞因子的特異性抗血清或單克隆抗體，因此可利用抗原抗體特異性反應(yīng)的特性，用免疫學(xué)技術(shù)定量檢測細(xì)胞因子。盡管細(xì)胞因子種類繁多，只要獲得了針對某一因子的特異性抗體（包括多克隆抗體或單克隆抗體）均可采用相似的技術(shù)開展工作。常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印跡法。目前，幾乎所有常見細(xì)胞因子的檢測試劑盒均有商品供應(yīng)。此外還可利用酶標(biāo)或熒光標(biāo)記的抗細(xì)胞因子單克隆抗體，原位檢測因子在細(xì)胞內(nèi)的合成及分布情況，如近來來發(fā)展起來的細(xì)胞內(nèi)染色法和酶聯(lián)免疫斑點（ELISPOT）技術(shù)等。免疫學(xué)檢測法可直接測定樣品中特定細(xì)胞因子的含量（用ng/ml表示），為大規(guī)模檢測臨床病人血清中細(xì)胞因子的含量提供了方便。本法僅測定細(xì)胞因子的抗原性，與該因子活性不一定相平行，因此要了解細(xì)胞因子的生物學(xué)效應(yīng)，必須結(jié)合生物學(xué)檢測法。

　　上述三種方法，各有優(yōu)缺點，可互相彌補(bǔ)，在實際應(yīng)用中，可根據(jù)各自的實驗?zāi)康暮蛯嶒炇覘l件進(jìn)行選擇。生物學(xué)檢測法比較敏感，又可直接測定生物學(xué)功能，是zui可靠的方法，適用于各種實驗?zāi)康模强蒲胁块Tzui常用的技術(shù)，但需要長期培養(yǎng)依賴性細(xì)胞株，檢測耗時長，步驟繁雜，影響因素多，不容易熟練掌握。免疫學(xué)檢測法比較簡單，迅速，重復(fù)性好，但所測定的只代表相應(yīng)細(xì)胞因子的量而不代表活性，同時敏感度也低于生物活性檢測法（約低10～100倍）。分子生物學(xué)法只能檢測基因表達(dá)情況，不能直接提供有關(guān)因子的濃度及活性等資料，主要用于機(jī)制探討。在檢測細(xì)胞因子時，必須考慮到細(xì)胞因子的作用具有網(wǎng)絡(luò)性的特點，人們需明確檢測方法所測定的細(xì)胞因子成分，并考慮其抑制劑和可溶性受體的水平，將各種結(jié)合使用，有可能得到較為可靠的結(jié)果。