ELISA方法操作步驟詳述

操作步驟 

方法一 

用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法: 

1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。 

2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。 

3.加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。 

4.加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。 

5.終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。 

6.結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零后測各孔O·D值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。 

方法二 

用于檢測未知抗體的間接法： 

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 

每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。 

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加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應孔 中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照) 

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于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml， 

37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。 

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其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。