慧穎生物談抗體芯片技術

抗體芯片技術

蛋白質是一切生命活動的基礎，受基因表達的調控，因而以檢測樣品中的mRNA為基礎的cDNA芯片是當今研究中倍受關注的研究手段。但是，由于存在著轉錄后加工、翻譯調控以及翻譯后加工等多種調節機制，基因的表達，或者說mRNA的水平并不必然代表蛋白質產物的水平。因此，以微陣列技術對生物樣品作整體蛋白質表達分析的蛋白芯片在后基因組時代越來越受重視。抗體芯片（Antibody Microarray，抗體微陣列），是蛋白質芯片的一種，是檢測生物樣品中蛋白表達模式的新方法。這種新技術使得研究人員可以在一次實驗中比較生物樣品中成百上千的蛋白質的相對豐度，將極大促進蛋白質組目前的研究狀況——因為以現有的技術中對蛋白質進行這種復雜的分析是非常困難的。

      Clontech公司*代的抗體芯片Ab Microarray 380（Cat.No.K1847-1）包含固定在玻璃片基上的378種已知蛋白質的單克隆抗體，可以在一次簡單實驗中同時檢測樣品中的378種蛋白質的表達情況，并且可以在一張芯片上對兩種樣品的表達模式進行比較分析。這使得抗體芯片在毒性實驗、疾病研究和藥物開發上有廣泛的應用前景。Ab Microarray 380芯片上每個抗體都是并列雙點以增加結果的可靠性，抗體針對廣泛的胞內蛋白和膜結合蛋白，已知參與信號傳導、癌癥、細胞周期調控、細胞結構、凋亡和神經生物學等廣泛的生物功能，因而可以用于檢測某一特定的生理或病理過程相關蛋白的表達模式。盡管抗原來自人，但很多抗體可以識別小鼠或大鼠的樣品。詳細的資料可以上網查詢。

      芯片上抗體的選擇不但根據其特異性，也根據抗體的結合親和力，在驗證實驗中特異性低、交叉反應高、或者信號強度低的抗體都被排除，另外所有抗體都經過檢驗保證得到的信號與抗原濃度有良好的線性相關，那些沒有良好的線性劑量關系的抗體都被排除。因此抗體芯片能夠檢測到樣品中很低的pg/ml濃度的抗原。

      *代的蛋白芯片和DNA芯片一樣是作為一種定性分析的工具，可用于分析樣品之間相關蛋白的相對表達豐度；還可以作為DNA芯片的補充，用于研究蛋白和基因表達之間的關系。

操作流程
      抗體芯片并不要求特殊的技能，只要一般常規的操作就可以完成以往極為復雜耗時的工作。整個操作流程包括：從50—200mg組織或細胞、體液中進行蛋白質抽提——用Cy5和Cy3兩種不同顏色的熒光分子分別標記兩個樣品——洗去多余的標記分子——與芯片雜交孵育——掃描分析結果。整個過程從樣品制備到結果分析只要一天即可完成，你只要準備好樣品、熒光染料、脫鹽純化柱（處理體液樣品時用）和熒光掃描儀，其他的試劑全部由試劑盒提供。

優化的試劑
      隨芯片試劑盒提供的蛋白抽提/標記緩沖液，是專門為抗體芯片而設計的，非常溫和的去垢劑在能抽提膜結合蛋白（相比SDS煮沸法能抽提95%以上的蛋白）的同時能保持蛋白的天然活性（非變性條件），這樣能夠保證抽提的蛋白的溶解性和代表性，保證以后的實驗結果的真實性，和原始材料的一致性。

Internally Normalized Ratio
      根據操作手冊進行內源標準化處理可以得到一個內源標準化信噪比（INR），內源標準化處理是指對兩個樣品（A、B）中分別用兩種熒光標記分子（Cy3和Cy5）標記，并交叉與芯片雜交（見圖，A-Cy5和B-Cy3一組,A-Cy3和B-Cy5一組分別和芯片雜交），可以作為消除抗原—抗體結合效率差異的對照，也可以消除潛在的不同熒光分子的標記效率差異。假如Cy5標記效率高于Cy3，單純一個實驗的結果就會有偏差（Cy5標記的樣品信號偏高），用這種雙向交叉反應就可以消除這種偏差。兩芯片雜交結果分別得到兩組Ratio值，通過免費下載的工具就可以自動算出每個抗體抗原的INR值，這就代表在兩個樣品間某個蛋白的相對豐度。這種內源標準化處理可以大大減小樣品分析的偏差。

      抗體芯片檢測的結果不是蛋白的含量而是378個目的蛋白在兩個樣品之間的相對豐度。值得注意的是由于抗體抗原結合的差異、標記差異等原因，根據芯片結果信號的強弱判斷同一樣品中兩種不同蛋白的多少是不恰當的。

特點
* 整個分析過程可以在一天內完成
* 用熒光分析的方法比較兩個樣品之間378個蛋白質的相對豐度
* 適用于包括組織、細胞系、體液在內的多種生物樣品
* 試劑盒提供完整的樣品抽提制備、標記、孵育所需的Buffer，特別設計的樣品制備的過程能保持樣品的完整性和溶解性，保證制備樣品具有代表性和一致性。
* 芯片上的抗體包含針對信號傳導、癌癥、細胞周期調控、細胞結構、凋亡和神經生物學等廣泛的生物功能的相關蛋白，跨度大、適用范圍廣。
* 芯片上的抗體分別經過特異性抗原、細胞系和組織的檢測，靈敏度高達pg/ml
* 開放性的芯片平臺設計，可以用各種型號DNA芯片熒光掃描儀進行檢測。