免疫學實驗要求

•  體液免疫功能檢測

–  抗體制備和檢測

–  未知抗原或抗體的體外檢測

•  細胞免疫功能檢測

–  PBMC的分離、擴增

凝集反應：

定義：顆粒性抗原+相應抗體——可見的凝集團塊

分類：直接凝集反應：玻片凝集   定性

                    試管凝集   半定量     定量抗原+系列稀釋抗體——不同程度的凝集反應——確定抗體滴度

      間接凝集反應：可溶性抗原+致敏顆粒+相應抗體——可見的凝集團塊

注意：

Ø  標記試管

Ø  正確使用滴管

Ø  *混勻

Ø  溫度: 56℃

Ø  記錄時間

Ø  輕拿試管，觀察結果，首先觀察對照管

瓊脂擴散實驗：

定義：可溶性抗原和抗體在瓊脂中擴散，相遇，在適當比例下形成沉淀線或沉淀環。

分類：單向瓊脂擴散實驗: 僅抗原或抗體擴散    定量實驗

      雙向瓊脂擴散實驗: 抗原和抗體同時擴散    定性實驗

注意：瓊脂板一定平整、光滑 (無氣泡).

瓊脂不可過厚

孔中液體不可過滿

體外抗體形成細胞檢測——QHS (Quantitative Hemolytic Spectrophotometric determination )定量溶血的分光光度檢測

原理：取SRBC免疫的小鼠脾臟細胞—— +SRBC+Complement —— 溶血——通過分光光度計定量檢測

注意：

Ø  新鮮SRBC

Ø  保持脾細胞活性

溶血素的收集和溶血素單位的滴定

原理：抗原與抗體結合，暴露抗體上抗原結合位點——Ag+Ab+C——補體活化——靶細胞裂解

酶聯免疫吸附試驗（ELISA)

定義：用酶標記抗原或抗體檢測液體（血液、細胞液）中未知抗體或抗原的方法。

分類：

Ø  間接法（Indirect ELISA）：

•      將已知抗原吸附于固相載體，酶標記二抗

•      檢測液相中未知抗體

Ø  雙抗體夾心法（Sandwich ELISA)：

•      將已知抗體吸附于固相載體，酶標記一抗

•      檢測液相中的可溶性抗原

Ø  競爭法（Competitive ELISA) ：

•      將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標記抗原或抗體

•      檢測液相中的可溶性抗原或抗體

間接法測定溶血素   ——定性檢測

注意事項：

•    洗滌*，避免交叉污染。

•    按順序加樣，孔底無氣泡。

•    包被和溫育在濕盒內進行。

補體結合反應（Complement fixation Test, CFT）

定義：是指在補體的參與下，以綿羊紅細胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗體）作為指示系統的抗原抗體反應。

原理：補反中包括兩個系統五種成分：

ü  待檢系統：已知Ag或Ab、待檢Ab或Ag及僅供一組Ag-Ab系統反應的定量補體。

ü  指示系統：綿羊紅細胞和溶血素。

注意事項：

•    綿羊紅細胞用前應輕晃混勻，不可劇烈震蕩。

•    各種試劑的吸管不可混用。

細胞免疫功能檢測

特異性細胞免疫是由T細胞介導的，因此，細胞免疫檢測通常是檢查T細胞的數量、功能及其產物如細胞因子等，是了解機體細胞免疫狀態的重要手段。

1.外周血單個核細胞的分離

原理：外周血+淋巴細胞分離液離心分層

      淋巴細胞 單核細胞    1.070g/l

      分離液               (1.077±0.002g/l)

粒細胞和紅細胞       (1.092g/l)

注意：

•    無菌操作.

•    注意血制品污染.

•    控制操作時間，保持細胞存活.

•    應用水平離心機.

2.E－花環形成實驗

人類T淋巴細胞表面CD2分子是綿羊紅細胞（SRBC）受體，也稱E受體，在一定條件下，SRBC環繞T細胞與之結合，形成花環狀，稱E花環（E-rosette），形成此種花環的細胞稱E花環形成細胞（簡稱E-RFC）。

3.淋巴細胞轉化實驗

T細胞在體外培養時，當受到非特異性的有絲分裂原（PHA）刺激后可轉化為淋巴母細胞，并進行有絲分裂，轉化的淋巴母細胞，在形態上出現了幼稚化，光鏡下很容易識別，可通過淋巴細胞轉化率反映機體T細胞免疫功能。