免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)要求

•  體液免疫功能檢測(cè)

–  抗體制備和檢測(cè)

–  未知抗原或抗體的體外檢測(cè)

•  細(xì)胞免疫功能檢測(cè)

–  PBMC的分離、擴(kuò)增

凝集反應(yīng)：

定義：顆粒性抗原+相應(yīng)抗體——可見(jiàn)的凝集團(tuán)塊

分類：直接凝集反應(yīng)：玻片凝集   定性

                    試管凝集   半定量     定量抗原+系列稀釋抗體——不同程度的凝集反應(yīng)——確定抗體滴度

      間接凝集反應(yīng)：可溶性抗原+致敏顆粒+相應(yīng)抗體——可見(jiàn)的凝集團(tuán)塊

注意：

Ø  標(biāo)記試管

Ø  正確使用滴管

Ø  *混勻

Ø  溫度: 56℃

Ø  記錄時(shí)間

Ø  輕拿試管，觀察結(jié)果，首先觀察對(duì)照管

瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)：

定義：可溶性抗原和抗體在瓊脂中擴(kuò)散，相遇，在適當(dāng)比例下形成沉淀線或沉淀環(huán)。

分類：?jiǎn)蜗颦傊瑪U(kuò)散實(shí)驗(yàn): 僅抗原或抗體擴(kuò)散    定量實(shí)驗(yàn)

      雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn): 抗原和抗體同時(shí)擴(kuò)散    定性實(shí)驗(yàn)

注意：瓊脂板一定平整、光滑 (無(wú)氣泡).

瓊脂不可過(guò)厚

孔中液體不可過(guò)滿

體外抗體形成細(xì)胞檢測(cè)——QHS (Quantitative Hemolytic Spectrophotometric determination )定量溶血的分光光度檢測(cè)

原理：取SRBC免疫的小鼠脾臟細(xì)胞—— +SRBC+Complement —— 溶血——通過(guò)分光光度計(jì)定量檢測(cè)

注意：

Ø  新鮮SRBC

Ø  保持脾細(xì)胞活性

溶血素的收集和溶血素單位的滴定

原理：抗原與抗體結(jié)合，暴露抗體上抗原結(jié)合位點(diǎn)——Ag+Ab+C——補(bǔ)體活化——靶細(xì)胞裂解

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)

定義：用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原的方法。

分類：

Ø  間接法（Indirect ELISA）：

•      將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記二抗

•      檢測(cè)液相中未知抗體

Ø  雙抗體夾心法（Sandwich ELISA)：

•      將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗

•      檢測(cè)液相中的可溶性抗原

Ø  競(jìng)爭(zhēng)法（Competitive ELISA) ：

•      將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記抗原或抗體

•      檢測(cè)液相中的可溶性抗原或抗體

間接法測(cè)定溶血素   ——定性檢測(cè)

注意事項(xiàng)：

•    洗滌*，避免交叉污染。

•    按順序加樣，孔底無(wú)氣泡。

•    包被和溫育在濕盒內(nèi)進(jìn)行。

補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)（Complement fixation Test, CFT）

定義：是指在補(bǔ)體的參與下，以綿羊紅細(xì)胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗體）作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。

原理：補(bǔ)反中包括兩個(gè)系統(tǒng)五種成分：

ü  待檢系統(tǒng)：已知Ag或Ab、待檢Ab或Ag及僅供一組Ag-Ab系統(tǒng)反應(yīng)的定量補(bǔ)體。

ü  指示系統(tǒng)：綿羊紅細(xì)胞和溶血素。

注意事項(xiàng)：

•    綿羊紅細(xì)胞用前應(yīng)輕晃混勻，不可劇烈震蕩。

•    各種試劑的吸管不可混用。

細(xì)胞免疫功能檢測(cè)

特異性細(xì)胞免疫是由T細(xì)胞介導(dǎo)的，因此，細(xì)胞免疫檢測(cè)通常是檢查T細(xì)胞的數(shù)量、功能及其產(chǎn)物如細(xì)胞因子等，是了解機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的重要手段。

1.外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離

原理：外周血+淋巴細(xì)胞分離液離心分層

      淋巴細(xì)胞 單核細(xì)胞    1.070g/l

      分離液               (1.077±0.002g/l)

粒細(xì)胞和紅細(xì)胞       (1.092g/l)

注意：

•    無(wú)菌操作.

•    注意血制品污染.

•    控制操作時(shí)間，保持細(xì)胞存活.

•    應(yīng)用水平離心機(jī).

2.E－花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)

人類T淋巴細(xì)胞表面CD2分子是綿羊紅細(xì)胞（SRBC）受體，也稱E受體，在一定條件下，SRBC環(huán)繞T細(xì)胞與之結(jié)合，形成花環(huán)狀，稱E花環(huán)（E-rosette），形成此種花環(huán)的細(xì)胞稱E花環(huán)形成細(xì)胞（簡(jiǎn)稱E-RFC）。

3.淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

T細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)受到非特異性的有絲分裂原（PHA）刺激后可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，并進(jìn)行有絲分裂，轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞，在形態(tài)上出現(xiàn)了幼稚化，光鏡下很容易識(shí)別，可通過(guò)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率反映機(jī)體T細(xì)胞免疫功能。