單鏈抗體的研究進展與展望

微囊藻毒素

微囊藻毒素是富營養化的淡水水體中常見的藻類毒素，它是一類具有蛋白磷酸酶抑制和

強烈致肝癌作用的環狀七肽。目前已經報道的微囊藻毒素已有 70 多種，其中微囊藻毒素 LR 是（microcystin LR, MC-LR）已知毒性zui強、急性危害zui大的一種淡水藍藻毒素。

以基因工程抗體技術的主流形式——噬菌體展示技術為例，目前利用噬菌體展示技術，篩選制備 MC-LR 的單鏈抗體或多肽配體的研究，已有少量報道。從鼠源合成噬菌體抗體庫中，快速分離獲得微囊藻毒素 LR 單鏈抗體

另外，由于單鏈抗體具有大規模、均一化生產等優點，有潛力應用于微囊藻毒素 LR 的免疫學檢測或免疫親和柱的制備，同時也探索了一種的微囊藻毒素 LR 單鏈抗體的庫篩選、鑒定方法。

河豚毒素

 河豚毒素（TTX）是一種小分子量的、胍鹽神經毒素它存在于河豚、蠑螈、斑足蟾等動物中的海洋毒素。它主要通過抑制神經或肌肉組織的鈉離子（Na⁺）電壓門控通道起作用，從而導致神經麻痹、呼吸困難甚至是死亡。但是到目前為止，針對河豚毒素的有效的、快速靈敏的檢測方法還沒有出現，而發展針對河豚毒素的免疫學方面的檢測方法是非常有必要的。

抗河豚毒素的基因工程單鏈抗體的制備

首先通過一種化學方法（曼尼希反應）來制備了河豚毒素的*人工抗原（TTX-BSA：作為檢測用抗原；TTX-KLH：作為免疫用抗原），并且采用了小量的、重復的免疫方式，實驗組總共免疫了3只Balb/c小鼠。從免疫好的小鼠的脾臟中提取其全RNA，并反轉錄合成cDNA的*條鏈，以此作為模板通過常規的PCR反應擴增了抗體的重、輕鏈的可變區基因（V_H和V_L），配以適當分子數的Linker（（G₄S）₃），通過重疊延伸PCR組裝成了一個可以無限制編碼抗河豚毒素（TTX）的重組的單鏈抗體（scFv）基因。通過噬菌體展示技術，構建了一個依托于噬菌體質粒載體pCANTAB-5E的噬菌體展示文庫。在經過輔助噬菌體M13KO7的再感染后，單鏈抗體就會展示在噬菌體的表面，然后再經過六輪的淘選過程，我們獲得了可以和河豚毒素（TTX）特異性結合的抗體，并通過間接ELISA對其進行了定量的分析，選定其中的一株親和力zui高的單克隆（scFv-T53）進行了單鏈抗體的可溶性表達和各方面性質的分析研究，通過間接ELISA測定選定的單克隆的親和力常數為1.1×10⁶L/mol。我們還通過生物信息學的手段，分析了scFv-T53的基因序列、氨基酸序列，預測了scFv-T53的可變區的劃分、二級結構、物理化學性質等。各種分析結果表面。本實驗成功的從構建的噬菌體抗體庫中篩選得到了特異的抗河豚毒素（TTX）的單鏈抗體。

1 單鏈抗體的特點

單鏈抗體是一種新型重組蛋白,它是把抗體可變區重鏈(VH)與輕鏈(VL)通過一段約15~25個氨基酸殘基構成的彈性短肽(Linker)相連而成,這種連接可以是VH linker VL,也可以是VL link-er VH。單鏈抗體是具有親代抗體全42部抗原結合特異性的zui小功能結構單位,具有分子量小(僅為完整抗體的1/6)、對腫瘤的穿透力強、血流中半衰期短、免疫原性低、可在原核細胞系統表達等特點。

2 單鏈抗體的研究進展

2.1 單價單鏈抗體

1988年,Bird[2]和Huston[3]等zui先研究成功單鏈抗體,他們用PCR技術從雜交瘤細胞的基因組DNA或其RNA反轉錄后的cDNA中擴增出VH和VL基因,用編碼彈性短肽的寡核苷酸將兩者連接起來,再將其插入原核細胞進行表達而獲得,并發現在大腸桿菌中表達的單鏈抗體能自發折疊成天然構象,其抗原親和性幾乎與完整抗體相同。1990年,Challdhary等[4]成功地制備了綠膿桿菌外毒素單鏈抗體基因,其表達的免疫毒素可識別并殺死攜帶OVB3抗原的細胞。在其后的十幾年時間里,研究人員進一步嘗試用酵母或植物細胞進行表達并獲得成功。

2.2 單鏈抗體多聚體

與典型的抗體不同,單價單鏈抗體只有一條輕鏈和一條重鏈,在與抗原結合方面還是稍遜于親本抗體,因此,人們采用易于形成螺旋或折疊的多肽基因,使其與VH和VL基因在表達系統中共同表達,從而產生雙價單鏈抗體。對連接VH和VL的Linker長度與單鏈抗體多聚體形成關系的研究認為[5]:如果選用由甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)組成長度為15~25個氨基酸殘基的Linker(序列為GGGGSGGGGSGGGGS),在折疊過程中,單鏈抗體的VH與VL功能區之間配

對,形成單價單鏈抗體;如果Linker縮短為3~12個氨基酸殘基,則同一單鏈抗體分子的VH與VL區就不能相互配對,而與不同單鏈抗體分子的VL與VH功能區配對成二價二聚體(即雙價單鏈抗體);如果Linker被進一步縮短為1~2個氨基酸殘基,VH的C端殘基就直接與VL的N端殘基相連,兩個單鏈抗體分子首先構成一個二價二聚體,兩端游離的VH和VL再與第三個單鏈抗體分子構成三價三聚體。如果不使用Linker,則表達產物折疊后更易形成三價三聚體。

2.3 雙特異性單鏈抗體

人們發現,可以利用兩種不同的單鏈抗體的VH和VL基因,使其在表達過程中實現重新組合,形成具有雙特異性的單鏈抗體,這種雙特異性單鏈抗體可以同時與兩種抗原特異性地結合。與傳統的雙特異性抗體相比,雙特異性單鏈抗體既保持了特異性結合抗原的特點又具有以下優點:1缺失Fc片段,減少了與FcR陽性細胞發生非特異性結合的可能性;ozui大限度地降低了鼠源性蛋白,降低了免疫變態反應的可能性;分子量小,有利于穿透腫瘤組織;避免了傳統制備雙特異性抗體需要進行細胞雜交的過程,減少了工作量,提高了制備的成功率。1993年Holliger等*次成功地制備了雙特異性單鏈抗體,目前已有十幾株抗體制備成功。

 單鏈抗體的不足與展望

單鏈抗體技術經過了 20 多年的發展，取得了巨大的成就，但是在應用中仍然存在一些問題，如親和力較低，穩定性較差，半衰期短等。

1. 單鏈抗體相對于其親本單克隆抗體，親和力低了 10-1000 倍，這成為它在免疫分析等應用中的一個制約因素，可以通過親和力成熟對單鏈抗體的親和力進行改進，或者通過構建多價抗體來增加抗體的功能親和性。
2. 單鏈抗體穩定性差，常常顯示聚集傾向，尤其在 37℃時穩定性較差，可以引入二硫鍵模擬天然狀態來穩定其結構，可使 VH 和 VL 形成穩定的異聚體 dsFv，再用相應載體系統進行構建。或者也可以將 ScFV 轉化為 Fab 做進一步的分析。
3. 單鏈抗體分子質量小，體內清除速度快，有時候達不到治療或診斷的時間。針對這一缺點，可以從多方面對 ScFv 進行改造，增加其抗原結合力，提高其親和力，其中 ScFv 多聚體是其改進形式之一，是通過將ScFv 連接肽縮短至 12 個氨基酸以下構成的一種新型小分抗體，在體內應用時具有很多優勢，克服了 ScFv 在體內清除過快的不足。但是，隨著分子生物學、分子免疫學、單鏈抗體展示、表達技術研究的深入，獲得各種目的的單鏈抗體指日可待。