Elisa直接法與間接法的區(qū)別

ELISA可用于測定抗原,也可用于測定抗體.在這種測定方法中有三個必要的試劑1)固相的抗菌素原或抗體,即"免疫吸附劑"(immunosorbent);(2)酶標記的抗原或抗體,稱為"結(jié)合物"(conjugate);(3)酶反應(yīng)的底物.根據(jù)試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件,可設(shè)計出各種不類型的檢測方法. 

ELISA可分類是根據(jù)抗原抗體的結(jié)合情況來分類的。 主要有以下幾種類型:（直接法也稱一步法） 1 雙抗體夾心法測抗原 

雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法,操作步驟如下: 

1) 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗體.洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì). 

2) 加受檢標本,保溫反應(yīng).標本中的抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物.洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì). 

3) 加酶標抗體,保溫反應(yīng).固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合.*洗滌未結(jié)合的酶標抗體.此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關(guān). 

4) 加底物顯色.固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物.通過比色,測知標本中抗原的量.在臨床檢驗中,此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法.如抗體的來源為抗血清,包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物.如應(yīng)用單克隆抗體,一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物.這種雙位點夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應(yīng),作一步檢測. 

在一步法測定中,當標本中受檢抗原的含量很高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結(jié)合,而不再形成"夾心復(fù)合物".類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象,此時反應(yīng)后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標準曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同(參見1.3.2,圖1-4),如按常法測讀,所得結(jié)果將低于實際的含量,這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)(hook effect),因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落.鉤狀效應(yīng)嚴重時,反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果.因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(zhì)(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)時,應(yīng)注意可測范圍的zui高值.用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng). 

假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇,例如HBsAg的a決定簇,也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物.但在HBsAg的檢測中應(yīng)注意亞型問題,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4個亞型,雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性,這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題. 

雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子(RF)的干擾.RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合.用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF,它可充當抗原成份,同時與固相抗體和酶標抗體結(jié)合,表現(xiàn)出假陽性反應(yīng).采用F(ab')或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑,由于去除了Fc段,從而消除RF的干擾.雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,已被列為這類試劑的一項考核指標。 

雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原,因其不能形成兩位點夾心. 2 雙抗原夾心法測抗體 

反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似.用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物,以檢測相應(yīng)的抗體.與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體.此法中受檢標本不需稀釋,可直接用于測定,因此其敏感度相對高于間接法.乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法.本法關(guān)鍵在于酶標抗原的制備,應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,尋找合適的標記方法. 3 間接法測抗體 

間接法是檢測抗體常用的方法.其原理為利用酶標記的抗抗體(抗人免疫球蛋白抗體)以檢測與固

相抗原結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法操作步驟如下: 

1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗原.洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì).2)加稀釋的受檢血清,保溫反應(yīng).血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物.經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去. 

3)加酶標抗抗體.可用酶標抗人Ig以檢測總抗體,但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體.固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標抗體抗體結(jié)合,從而間接地標記上酶.洗滌后,固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關(guān). 

4)加底物顯色本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷.間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法.間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度.雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結(jié)果,但應(yīng)盡可能予以純化,以提高試驗的特異性.特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì),例如以E.Coli為工程酶的重組抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng).抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì),例如來自人血漿或人體組織的抗原,如不將其中的Ig去除,試驗中也發(fā)生假陽性反應(yīng).另外如抗原中含有無關(guān)蛋白,也會因竟爭吸附而影響包被效果. 

間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性.病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分.IgG的吸附性很強,非特異IgG可直接吸附到固相載體上,有時也可吸附到包被抗原的表面.因此在間接法中,抗原包被后一般用無關(guān)蛋白質(zhì)(例如牛血清蛋白)再包被一次,以封閉(blocking)固相上的空余間隙.另外,在檢測過程中標本須先行稀釋(1:40~1:200),以避免過高的陰性本底影響結(jié)果的判斷.