ATDC-5-EGFP細胞-小鼠軟骨細胞株

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，簡稱ChIP）是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)。它利用抗原抗體的特異性反應，可以真實地反映體內(nèi)蛋白分子與基因組DNA結(jié)合的狀況。下面我們就zui基本的實驗步驟，實驗中的小技巧以及需要注意的問題簡單介紹一下。

1.  細胞固定

    甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復合體，防止細胞內(nèi)組分的重新分布。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時間通常為5分鐘到1個小時。需注意的是，交聯(lián)時間如果過長，細胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不*，產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應可被加入的甘氨酸終止。

2.  染色質(zhì)片段化

    交聯(lián)后的染色質(zhì)需被超聲波切成400~600bp的片段，以便目的蛋白的暴露，利于抗體識別，其片段破碎的均勻一致性對結(jié)果影響至關(guān)重要。傳統(tǒng)的超聲波破碎是利用機械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會引起蛋白質(zhì)變性，進而影響ChIP的效率。而來自比利時的Bioruptor非接觸式超聲波破碎儀采用溫和的破碎方式，保證了蛋白的活性，DNA破碎效果均一，同時外接水循環(huán)儀保證了實驗的溫度穩(wěn)定性，成為目前ChIP實驗的。

3.  染色質(zhì)免疫沉淀反應

Input對照：

在進行免疫沉淀前，需要取一部分斷裂后的染色質(zhì)做Input對照。Input需要與沉淀后的樣品DNA一起經(jīng)過逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，DNA純化，以及zui后的檢測。Input對照不僅可以驗證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對照是ChIP實驗*的步驟。

Beads選擇：

接下來，利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過抗原-抗體特異反應形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復合物，然后使用Agarose beads或Magnabeads沉淀此復合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過多次洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復合物。

抗體選擇：

染色質(zhì)免疫沉淀所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實驗成功的關(guān)鍵。因為在蛋白質(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時，抗體的抗原表位可能因為與結(jié)合位點的距離太近，不能被抗體識別，所以不能有效地在體內(nèi)形成免疫沉淀復合物，直接影響ChIP的結(jié)果。

陰性對照設(shè)置：

在做ChIP實驗時，需設(shè)置對照，以便于對實驗結(jié)果的可靠性進行評估。陽性抗體和陰性抗體對照是zui基本的實驗對照。陽性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNAPolymerase II抗體等。陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。目的蛋白抗體的結(jié)果與陽性抗體和陰性抗體的結(jié)果相比較，才能得出正確結(jié)論。另外，還應考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結(jié)合的可能，所以通常還會選擇一對陰性引物，即目的蛋白肯定不會結(jié)合的DNA序列，作為該抗體的陰性對照。*的陰性對照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結(jié)合的序列。如果目的蛋白沒有商品化的適用于染色質(zhì)免疫沉淀實驗的抗體，只有其他用途的抗體時，可以先做蛋白質(zhì)免疫沉淀檢測。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進行染色質(zhì)免疫沉淀實驗的檢測。

4.  交聯(lián)反應的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化

用不含DNase的RNase和Proteinase K，65℃保溫6小時逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，經(jīng)DNA純化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。在逆轉(zhuǎn)交聯(lián)時不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有機相中的蛋白質(zhì)，進行分析。

5.  DNA的鑒定

zui常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于啟動子區(qū)域序列多樣性的特點，所以不同的細胞系或不同的動物品系的同一基因的啟動子序列有可能不同，因此可設(shè)計多對引物來反復驗證ChIP實驗的結(jié)果.

慧穎細胞庫400種類細胞株細胞系，20多株耐藥株，超低折扣，種類涵蓋：成纖維細胞 長尾綠猴胚胎細胞 長尾綠猴腎細胞 小鼠乳腺癌細胞 人膀胱癌細胞 人T細胞白血病細胞 人腎細胞腺癌細胞 人腎透明細胞腺癌細胞 人甲狀腺癌細胞 卵巢癌細胞 干細胞 結(jié)腸癌細胞 胃癌細胞 乳腺類細胞 等

以下為購買細胞系后的售后小知識：

1、CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？

定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

2、為何培養(yǎng)基保存于4 ℃ 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？

培養(yǎng)基保存于4 ℃ 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑（通常為phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。

3、各種細胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？

不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細胞沒有太大之影響， 惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。

4、購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形？ 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–80℃太久。

慧穎生物熱賣細胞代號：OVCAR-5細胞，IMR-90細胞，A2780細胞，A2780/DDP細胞，SH-SY-5Y細胞，A431細胞，L Wnt-3A細胞，WRO細胞，IOSE80細胞，SW48細胞，COV434細胞，KGN細胞，SUM229PE細胞，SUM159PT細胞，SHIN3細胞，NCM460細胞，HFF細胞，HTR8-SVNEO細胞，MLE-12細胞，RS4：11細胞，HELF細胞，MRTEC細胞，HT-3細胞，LNCAP細胞，RAW264.7細胞等。

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，簡稱ChIP）是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)。它利用抗原抗體的特異性反應，可以真實地反映體內(nèi)蛋白分子與基因組DNA結(jié)合的狀況。下面我們就zui基本的實驗步驟，實驗中的小技巧以及需要注意的問題簡單介紹一下。

1.  細胞固定

    甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復合體，防止細胞內(nèi)組分的重新分布。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時間通常為5分鐘到1個小時。需注意的是，交聯(lián)時間如果過長，細胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不*，產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應可被加入的甘氨酸終止。

2.  染色質(zhì)片段化

    交聯(lián)后的染色質(zhì)需被超聲波切成400~600bp的片段，以便目的蛋白的暴露，利于抗體識別，其片段破碎的均勻一致性對結(jié)果影響至關(guān)重要。傳統(tǒng)的超聲波破碎是利用機械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會引起蛋白質(zhì)變性，進而影響ChIP的效率。而來自比利時的Bioruptor非接觸式超聲波破碎儀采用溫和的破碎方式，保證了蛋白的活性，DNA破碎效果均一，同時外接水循環(huán)儀保證了實驗的溫度穩(wěn)定性，成為目前ChIP實驗的。

3.  染色質(zhì)免疫沉淀反應

Input對照：

在進行免疫沉淀前，需要取一部分斷裂后的染色質(zhì)做Input對照。Input需要與沉淀后的樣品DNA一起經(jīng)過逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，DNA純化，以及zui后的檢測。Input對照不僅可以驗證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對照是ChIP實驗*的步驟。

Beads選擇：

接下來，利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過抗原-抗體特異反應形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復合物，然后使用Agarose beads或Magnabeads沉淀此復合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過多次洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復合物。

抗體選擇：

染色質(zhì)免疫沉淀所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實驗成功的關(guān)鍵。因為在蛋白質(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時，抗體的抗原表位可能因為與結(jié)合位點的距離太近，不能被抗體識別，所以不能有效地在體內(nèi)形成免疫沉淀復合物，直接影響ChIP的結(jié)果。

陰性對照設(shè)置：

在做ChIP實驗時，需設(shè)置對照，以便于對實驗結(jié)果的可靠性進行評估。陽性抗體和陰性抗體對照是zui基本的實驗對照。陽性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNAPolymerase II抗體等。陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。目的蛋白抗體的結(jié)果與陽性抗體和陰性抗體的結(jié)果相比較，才能得出正確結(jié)論。另外，還應考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結(jié)合的可能，所以通常還會選擇一對陰性引物，即目的蛋白肯定不會結(jié)合的DNA序列，作為該抗體的陰性對照。*的陰性對照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結(jié)合的序列。如果目的蛋白沒有商品化的適用于染色質(zhì)免疫沉淀實驗的抗體，只有其他用途的抗體時，可以先做蛋白質(zhì)免疫沉淀檢測。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進行染色質(zhì)免疫沉淀實驗的檢測。

4.  交聯(lián)反應的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化

用不含DNase的RNase和Proteinase K，65℃保溫6小時逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，經(jīng)DNA純化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。在逆轉(zhuǎn)交聯(lián)時不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有機相中的蛋白質(zhì)，進行分析。

5.  DNA的鑒定

zui常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于啟動子區(qū)域序列多樣性的特點，所以不同的細胞系或不同的動物品系的同一基因的啟動子序列有可能不同，因此可設(shè)計多對引物來反復驗證ChIP實驗的結(jié)果.

慧穎生物供應ATCC細胞，癌細胞，干細胞，植物細胞，國產(chǎn)細胞，*的atcc細胞，atcc傳代細胞，sciencell細胞，sciencell原代細胞，細胞培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)技術(shù)，原代細胞培養(yǎng)，動物細胞培養(yǎng)，植物細胞培養(yǎng)提供者。提供400多種類細胞株細胞系，20多株穩(wěn)定耐藥株，*，質(zhì)量穩(wěn)定，細胞飽滿，立體感強，活力強，傳代次數(shù)少，*！

細胞凍存是細胞培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)之一。利用凍存技術(shù)將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。

凍存技術(shù)要點是慢凍，標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min。我們常用的傳統(tǒng)方法是將凍存管置于4℃30分鐘--->-20℃60分鐘--->-80℃隔夜--->液氮罐。但是由于步驟較多，時間間隔較長，很容易遺忘。但是任何一個步驟的拖延都會嚴重影響細胞存活。而市面上程序冷凍儀又價格昂貴，必要性也不高，不是每個實驗室都擁有的。

方法改進：我們考慮到泡沫塑料有很好的保溫隔熱效果，同時又注意到我們購買的BD公司的15ml離心管包裝里的泡沫塑料孔徑與凍存管相當。我們改進的凍存方法是：可將細胞凍存管放入泡沫支架中，再加蓋一塊同樣的泡沫支架后，直接放入-80℃冰箱隔夜后轉(zhuǎn)移進液氮罐。該方法不但利用了廢物利于環(huán)保，而且省時省心，非常便捷有效。

慧穎生物熱賣細胞株細胞系：ATDC-5-EGFP細胞-小鼠軟骨細胞株；MC38細胞-小鼠結(jié)腸癌細胞株；DC2.4細胞-小鼠樹突狀細胞株；L Wnt-3A細胞-小鼠皮下結(jié)締組織細胞株；MC3T3-E1細胞-小鼠胚胎成骨細胞前體細胞株；NIH/3T3細胞-小鼠胚胎成纖維細胞株；T24細胞-人膀胱移行細胞癌細胞株；A2780/DDP細胞-人卵巢癌耐DDP細胞株；Hep G2細胞-人肝癌細胞株等。