SH30084.03

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質雙層的內(nèi)側，細胞發(fā)生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側翻向外側。Annexin V是一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。在細胞發(fā)生凋亡時，膜磷脂酰絲氨酸外翻的發(fā)生早于細胞核的變化，而此時Propidium Iodide（PI）不能通過細胞膜。

細胞壞死時，雖然也會發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻，但此時細胞膜的通透性明顯增加，PI等核酸染料進入細胞與細胞核中的核酸結合，發(fā)出紅色熒光。所以Annexin V-FITC(綠色熒光)常與鑒定細胞死活的核酸染料（如PI）合并使用，來區(qū)分凋亡細胞與死亡細胞。

技術原理及步驟

1. 離心收集細胞，微量離心機轉速1000 rpm，離心時間5 min，棄培養(yǎng)基。

2. 用冷PBS洗滌細胞兩次。

3. 用400 μL1× Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約為1×106 cells/mL。

4. 在細胞懸浮液中加入5 μlLAnnexin V-FITC，輕輕混勻后于2~8°C避光條件下孵育15min。

5. 加入10 μL PI后輕輕混勻于2~8°C避光條件下孵育5 min。

6. 在1小時內(nèi)用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。

應用實例

應用領域

細胞的早期凋亡及區(qū)分凋亡與壞死細胞

服務周期

我公司在正式接受實驗委托2個星期左右完成實驗并提供實驗報告。

客戶須知（對材料的要求、注意事項）

需提供細胞類型，處理條件。

慧穎生物專業(yè)血清10年，我們不生產(chǎn)血清，我們只是高品質動物血清的搬運工

血清是一種成分復雜的混合物，不同批次血清對細胞生長的促進作用不同。大規(guī)模細胞培養(yǎng)中由血清引起的細胞生長狀態(tài)不佳及病毒滴度的影響表現(xiàn)在以下幾個方面：

1、細胞生長速度緩慢，長滿單層時間長；從同一細胞瓶中分出兩瓶細胞，用同一種培養(yǎng)液，分別加入10％的對照血清和待檢血清，在相同條件下培養(yǎng)72小時，會出現(xiàn)對照血清長滿單層，而待檢血清大約只有60～70％，這種血清就不適合用來大規(guī)模培養(yǎng)細胞。

2、細胞傳代后形態(tài)不正常，細胞狀態(tài)發(fā)生變化 ；由于血清的質量問題，使原本狀態(tài)正常的細胞經(jīng)傳代后形態(tài)會變差；比如：細胞瓶里會出現(xiàn)一些蠕動的小黑點（并非污染），或者細胞表面形成一層油狀覆蓋物；細胞的輪廓變得模糊，細胞之間的間隙被血清中的蛋白顆粒填充，從而影響細胞向四周擴展生長。

3、細胞傳幾代后就出現(xiàn)脫壁現(xiàn)象，不能連續(xù)傳代 ；質量較差的血清缺乏某種細胞的貼壁因子，會使細胞在傳代過程中逐漸喪失貼壁的能力。細胞會從正常的貼壁狀態(tài)，邊緣開始萎縮，上翹。觀察到的現(xiàn)象就是細胞表面不光滑，晃動細胞瓶會看到細胞表面有絮狀物隨培養(yǎng)液波動。隨著傳代次數(shù)增加，細胞萎縮的情況越來越嚴重，直到zui終*脫壁而死亡。

4、細胞長的很好，致密的單層，狀態(tài)也很正常，但是接毒后細胞基本不發(fā)生病變，做滴度檢測幾乎測不出抗原滴度。這種情況也許是因為血清中含有與接種的病毒有同源的特異性抗體。比如血清中經(jīng)常會存在乙腦抗體，牛腹瀉病毒抗體等，如果存在這些抗體，就會把接進去的病毒給中和掉。如果抗體滴度很高，病毒會被抗體*中和，就沒有病毒顆粒在細胞中增殖，所以會檢測不到病毒滴度。這種情況給疫苗企業(yè)造成的損失是相當大的，不產(chǎn)毒等于前面所做的那么多工作全部白費，浪費人力、物力，尤其是時間上的浪費，從培養(yǎng)細胞開始到接病毒，到收液至少需要一兩個月，一旦出現(xiàn)不產(chǎn)毒的情況，那么這一兩月時間就白白浪費掉了，這也是牛血清給疫苗企業(yè)造成的風險之一。

5、細胞生長的狀態(tài)一般，產(chǎn)毒少，毒價低。這種情況比較常見，細胞是病毒的載體，由于血清質量不好，導致細胞生長狀態(tài)不好，病毒就無法進行正常的復制。并非所有病毒都不能復制，所以就造成疫苗的效價不夠，可能造成不合格產(chǎn)品。

看來一款血清直接關系細胞的生死存亡，不用擔心，慧穎提供無支原體，低內(nèi)毒素和低血紅素的，無反復凍融的高品質血清

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