SH30070.03

TUNEL細胞凋亡檢測 (TUNEL Apoptosis Assay)是一種高靈敏度又快速簡便的細胞凋亡檢測方法。對于待檢測的細胞或組織樣品，經過生物素標記和后續的DAB顯色等步驟，即可在普通光學顯微鏡下觀察到凋亡細胞。

細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測，可以發現180-200bp的DNA ladder。

基因組DNA斷裂時，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)標記的dUTP(Biotin-dUTP)，隨后和辣根過氧化物酶(HRP)標記的Streptavidin (Streptavidin-HRP)結合，zui后在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞，從而可以通過普通光學顯微鏡檢測到凋亡的細胞。

技術步驟

1. 材料與試劑 (以Promega試劑盒為例)，包括：

(1)生物素標記的-dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛標記的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP) 1 nmol/µL

(2)TdT酶（25U/μL）

(3)反應緩沖液

(4)洗滌緩沖液

(5)異硫氰酸熒光素（FITC）標記的親合素或鏈霉親合素（2.5µg/mL）或抗地高辛抗體（1︰30）

(6)PI染液（含PI 5µg/mL及無DNA酶活性的RNA酶0.1%）

(7)PBS緩沖液

(8)塑料蓋玻片

2. 樣品

(1)懸浮生長培養細胞的甩片或涂片

(2)貼壁生長的培養細胞

(3)冰凍切片

(4)常規石蠟切片

3. 操作方法

(1)固定：培養細胞的制片或冰凍切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常規4%中性福爾馬林固定、石蠟包埋之切片進行脫蠟、水化。

(2)洗滌：玻片浸入PBS緩沖液，搖床上洗滌5min，三次。

(3)反應：洗滌后的玻片用吸水紙吸干細胞或組織周圍水分，按50μl/cm2滴加反應液（每50μL反應液含TdT酶0.5μL,標記的-dUTP 1μL），使反應液均勻地覆蓋于所有細胞或組織切片上，蓋上塑料蓋玻片，置濕盒中，37℃孵育1h。

(4)終止反應：去掉塑料蓋玻片，將玻片置盛有洗滌緩沖液的染色缸內，洗滌兩次，每次5min。

(5)FITC標記：洗滌后的玻片用吸水紙吸去細胞或組織周圍水分，按50μl/cm2滴加FITC反應液（含FITC 2.5μg/mL），室溫下避光孵育10min。

(6)洗滌：將玻片置于洗滌緩沖液內，洗兩次，每次5min。

(7)PI復染：將玻片置于盛有PI染液的染色缸內，室溫下避光染色30min。

(8)封片：用蓋玻片直接蓋在含PI染液的玻片上，亦可用無色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣，置暗盒中，盡早鏡檢觀察。

4. 結果判定：用熒光顯微鏡觀察，選用藍色激發光（波長488nm），所有的細胞核均被PI著色，顯示出紅色熒光，而凋亡細胞被特異地標記上FITC，顯示出黃綠色熒光。

應用領域

細胞凋亡(apoptosis)的分析方法，細胞凋亡有一項重要的特征為細胞內的DNA會碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的去探測DNA片段的產生。

服務周期

交貨時間： 15~20天

客戶須知（對材料的要求、注意事項）

結果提供： 正常和陽性對照玻片及其1張數碼照片，剩余石蠟塊，檢測報告；

樣本要求：取材保持組織新鮮（組織塊以小于2cm×1.5cm×0.3cm為宜），立即放入固定液（固定液用10%福爾馬林液或4%多聚甲醛緩沖液，體積為組織塊的10倍以上）中，避免干燥；對于有血跡的樣本，可用PBS液或生理鹽水沖洗后直接放入固定液中；經固定后的樣本必須在48小時內處理。

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