人結腸癌氟尿嘧啶耐藥株

1.試劑和溶液

乙醇: 無水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇

抗原修復液: 0.01M的檸檬酸鈉緩沖液：58.82g檸檬酸三鈉及7.56g檸檬酸溶于200ml純水，調pH至 6.0，純水1:100稀釋為工作液

3%過氧化氫-甲醇: 30%的過氧化氫與無水甲醇1:9稀釋

10X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L純水，調pH至 7.4

洗滌液: 1×PBS：純水稀釋10× PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS（1×PBST）super block，生物素標記的UltraTekAnti-Polyvalent二抗，酶標親和素UltraTek HRP，DAB

顯色試劑盒：Cat. KT1002a

抗體稀釋液：3%BSA-PBS

0.5%鹽酸-乙醇：0.5～1%鹽酸，95.0～95.5%乙醇

蘇木素：蘇木精2g溶于250ml無水乙醇，十六水合硫酸鋁17.6g 溶與750ml純水，以上溶液充分混合，加入碘酸鈉 0.2g和冰醋酸20ml

2.實驗步驟

1組織固定：烘箱溫度65-75℃ 30min或者65℃隔夜；

2脫蠟：二甲苯浸泡三次，每次10分鐘；

3水化：依次經過無水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；

4洗滌：自來水沖洗1次，PBS浸泡3min；

5抗原修復：放入稀釋100倍的檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0) 中，高壓鍋煮沸10min，常溫冷卻30min；

6洗滌：純水浸泡2次，PBS浸泡1次，每次3min；

7滅活酶：室溫下3%過氧化氫-甲醇暗處處理切片15min；

8洗滌：純水浸泡1次，PBS浸泡2次，每次3min；

9封閉：加入適當體積的super block（KT1002a Reagent A），37℃溫箱孵育5min；

10洗滌：純水浸泡1次，PBS浸泡2次，每次3min；

11一抗：加入反應體積為0.15ml，適合濃度的一抗, 37℃ 濕盒孵育60min。

12洗滌：PBST浸泡3次，PBS浸泡1次，每次3min；

13加入適當體積生物素標記的UltraTek Anti-Polyvalent的二抗（KT1002a Reagent B），37℃濕盒孵育10min；

14洗滌：PBST浸泡3次，PBS浸泡1次，每次3min；

15加入適當體積酶標親和素UltraTek HRP（KT1002a Reagent C）, 37℃濕盒孵育10min；

16洗滌：PBST浸泡3次，PBS浸泡1次，每次3min；

17顯色：滴加適量DAB顯色液(KT1003a)至切片上，室溫顯色1~5min，自來水沖洗；

18復染：蘇木素染色5min，蒸餾水沖洗5min；

19分化： 0.5%鹽酸乙醇混合液中分化，自來水沖洗3-4次， PBS中浸泡10-20秒返藍，自來水沖洗2次。

20脫水：經過70%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，無水乙醇浸泡，每次5min；

21透明：二甲苯浸泡2次，每次10-15min；

22封片：晾干后加中性樹膠，蓋玻片封片；

23結果：顯微鏡觀察，記錄結果。

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