RPMI 1640細胞培養液的配制

RPMI 1640細胞培養液的配制  

1. 配制培養基使用新制備的三蒸水。一般在試驗前當天或前一天制備為好。調節pH值的酸堿溶液也應該使用這種水配制。

2. 制備培養基的器皿清洗要干凈，烤干后備用（濾器、濾膜、量筒、移液管及盛放培養基的小瓶等存放和轉移培養基液體的器具都應進行滅菌）。

3. 溶解培養基：將干粉培養基溶于總量1/3的水中，再用水洗包裝袋內面兩次，倒入培養液中。振蕩或超聲助溶，一般不要加熱助溶。

4. 補加試劑：根據包裝袋說明和試驗需要加入NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等其他試劑。 

5. 加抗生素：一般抗生素終濃度為――青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml。市售青霉素為80萬U／瓶，可溶于4ml體積，每一升培養液中加0.5ml即可。市售鏈霉素為100萬U／瓶，可溶于5ml體積，每一升培養液中也加0.5ml即可。無鏈霉素的情況下，用慶大霉素代替，終濃度調為50～200U/ml。

6. 調pH值：加水到900ml（在需要加10％小牛血清的情況下），然后用5％ NaHCO3 調節pH到7.2。 

7. 過濾除菌：宜采用0.45um和0.22um濾膜各一張，上層為0.45um，下層為0.22um，以保證過濾效果。注意濾膜正面（光面）朝上。過濾后分裝于小瓶中（100或200ml）。

8. 加小牛血清：根據培養基配制的量將小牛血清分裝，冷凍保存（－20℃）。臨用前將加入小牛血清(10%~20%)。 

【注意事項】  每次配液時，需要的其他輔助性液體（Hanks，胰蛋白酶消化液，PBS，抗生素溶液等）也可以同時配制，分別過濾。  市售小牛血清使用前都應該滅活（56℃，30min），以消除補體活性。動物血清個體差異大，故而每一批血清都進行嚴格檢測，同時進行無菌試驗。血清應該為淡黃色，透明，無溶血，無沉淀，滅活后顏色稍深。生化檢測總蛋白含量3.5~4.5g/100ml，球蛋白不高于2g／100ml。選定一個效果較好的批號后，可一次多購該批號的血清，保證試驗條件的穩定。  由于市售小牛血清pH未知，但大多偏酸。試驗中加入小牛血清后，培養基的pH可能還會變化，故亦可先加入小牛血清后調pH值。但此種方法過濾較困難，只適于正壓過濾。  培養液配好后，應先抽取少許放入培養瓶內，于37℃溫箱內置24～48hr，以檢測培養液是否有污染。  每次配液量以兩周左右為宜，一次配液不要太多，防止營養成分（主要為谷氨酰胺）損失，造成實驗繁瑣或者污染。 

細胞培養基DMEM的配制（初學）  2010.07.02  細胞培養基是由合成培養和小牛血清配制而成。合成培養基有商品出售，它是根據細胞生長的需要按一定配方制成的粉狀物質。其主要成分是氨基酸、纖維素、碳水化合物、無機離子和其它輔助物質。它的酸堿度和滲透壓與活體內細胞外液相似。小牛血清含有一定的營養成分，更重要的是它含有細胞生長所必須的生長因子、激素、貼附因子等，這是合成培養基無法替代的。此外它還能中和有毒物質的毒性。故一般體外培養細胞時要加入一定量的小牛血清（１0%）。

【儀器、材料和試劑】

1．儀器：蠕動泵1套，濾器，高壓蒸汽滅菌鍋，磁力攪拌器，pH計。

2．材料：3000mL錐形瓶，250mL或500mL培養液瓶，0.22mm的微孔濾膜。

3．試劑：雙蒸水，小牛血清，合成培養基（DMEM），NaHCO3。

【操作步驟】 

1．過濾器的準備和安裝

（1）清洗好過濾器，干燥 

（2）將一張0.22mm的微孔濾膜在DDW中浸泡后放入濾器，注意不要有氣泡。

（3）用布或報紙包裝好，121℃ 30min進行高壓蒸汽滅菌處理。

（4）在超凈臺內安裝好過濾裝置，準備過濾。

2．合成培養基的配制 DMEM    13.5g NaHCO3     3.7g       HEPES   2.38g DDW溶解  10M的NaOH調pH為7.5   定容1L 

(1)將干粉型培養基DMED溶于300ml的三蒸水中，再用300ml水沖洗包裝內面兩次，倒入培養液中，以保證所有干粉都溶解成培養液。 

(2)加入NaHCO3 3.7g  HEPES   2.38g。磁力攪拌器攪拌。*溶解即可，不易在空氣中攪拌過長時間，大量的CO2融入會影響培養基的pH

（3）正常情況下用10M的NaOH調pH為7.5。

（4）過濾除菌。于超凈臺中濾器過濾。 

（5）濾前、濾后分別取10ml的培養基于15ml的離心管中，置37℃ 24h，檢測是否無菌。 

（6）檢測無污染后，2℃－8℃下避光保存。  

（7）使用時加入加抗生素：zui終濃度青霉素為100U/ml，鏈霉素100μg/ml。一般市售青霉素為80萬U/瓶，將其溶解在4ml體積內，每1000ml培養液中加0.5ml，即成zui終濃度為100U/ml。市售鏈霉素為100萬U/瓶，將其溶解5ml體積內，也是每1000ml加0.5ml，使其zui終濃度為100μg/ml。

（8）加入小牛血清  市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補體。  將血清放入56℃水浴中30min，其間要不時輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉淀析出。根據培養基量加入小牛血清，使其終濃度為10%。  每次配液量以使用兩周左右的量為宜。一次配液不要太多，一是營養成分有損失，二是容易污染。